傷口愈合測定是一種研究體外細胞遷移的簡單方法。ibidi Culture-Insert 傷口愈合插件系列產品為傷口愈合實驗提供了完整的解決方案，從樣品制備到圖像分析只需四個步驟。

　　本應用是使用ibidi Culture-Insert 2 Well傷口愈合插件分析MCF-7細胞遷移的詳細方案。

圖 1. 使用ibidi Culture-Insert 2 Well行傷口愈合測定的實驗工作流程

　　實驗操作流程：

　　步驟1:細胞接種

　　為建立可靠的數據采集系統，須在實驗開始前確定實驗參數。例如：選擇正確的細胞接種密度。我們建議使用24小時后產生百分之100光學融合細胞層的密度。

　　1.像往常一樣準備細胞懸液。建議包括離心步驟，以去除死細胞和細胞碎片。將細胞懸浮液調節至約3x105個細胞/ml的細胞濃度，以在24小時后獲得融合的細胞層。

　　2. 將70µl細胞懸液滴入培養皿2孔插件的每個孔中。避免搖晃µ-Dish培養皿，因為這將導致細胞分布不均勻。

　　3. 將細胞在37°C和百分之5 CO2下培養至少24小時。

圖2. 在高壁預置傷口愈合2孔插件培養皿中接種細胞

　　步驟2:劃痕形成

　　融合細胞層是開始該測定的先決條件。移除高壁傷口愈合2孔插件培養皿后加入新鮮培養基。如有必要，在培養基中補充抑制或增強物質，以評估其對細胞遷移行為的影響。

　　1. 24小時后在顯微鏡下檢查細胞密度。如果24小時后仍未形成細胞融合層，則將µ-Dish培養皿再次放入細胞培養箱中再培養12-24小時。定期檢查匯合處。

　　2. 用無菌鑷子輕輕取出傷口愈合2孔插件培養皿。如圖3所示，用鑷子輕輕夾住插件的一角取出插件。

圖3.使用無菌鑷子移除傷口愈合2孔插件培養皿

　　3.移除插件后，檢查細胞層是否仍附著在μ-Dish培養皿的表面。

　　4.用無細胞培養基或PBS清洗細胞層，去除細胞碎片和未附著的細胞。

　　5.推薦使用體積為2mL的無細胞培養基填充μ-Dish培養皿。

圖4. 由高壁預置傷口愈合2孔插件培養皿創建的無細胞間隙

　　步驟3：獲取顯微鏡圖片：

　　我們建議錄制延時視頻，以確定時間依賴性和細胞遷移的特征。

　　1. 將培養皿放在顯微鏡上并移動，直到圖像中捕捉到間隙和兩個細胞的正面。使用4x/5x或10x物鏡。傷口區域的方向并不重要，但需要水平或垂直。

　　2. 在接下來的幾個小時內，通過多次拍攝圖像開始觀察過程。

　　3. 以30分鐘的時間間隔對在ibiTreat表面上培養的MCF-7細胞進行20小時的時間推移測量。

圖5.使用MCF-7細胞的遷移測定的時間流逝測量

　　步驟4：使用FastTrack AI和數據解釋進行定量圖像分析

　　必須分析顯微照片以獲得關于培養細胞的遷移特征的信息。這可以通過使用圖像處理軟件手動完成，也可以通過使用ibidi提供的傷口愈合快速通道人工智能圖像分析進行自動圖像分析。

　　這里顯示的示例數據是使用FastTrack AI進行分析的。自動圖像分析檢測細胞覆蓋面積。繪制細胞覆蓋面積隨時間的變化圖，顯示間隙閉合的過程。線性相位可以用來表征遷移(=傷口閉合的速度)。

　　線性相的斜率顯示，劃痕閉合的平均速度為0.0184*106µm2/小時（=0.44*106µm2/天）。

圖6. FastTrack AI對傷口愈合實驗的定量圖像分析

　　高壁預置傷口愈合2孔插件培養皿放置在細胞培養表面上，提供兩個細胞培養庫，每個庫由一條500μm壁隔開。在兩個儲液庫中填充細胞懸浮液僅允許細胞在設置區域生長。移除培養插件在適當的細胞附著后，產生大約500 μm的無細胞間隙。

　　在顯微鏡評估傷口愈合過程。根據您感興趣的焦點，可以通過使用視頻顯微鏡或通過在不同時間點觀察圖像來完成。測量細胞覆蓋區域的變化允許量化傷口閉合的速度并提供細胞遷移特征。